8:30 AM Makalah Kloning

Kloning

Pengantar

Kloning berasal dari bahasa Yunani; clone (klon) yang bermakna harafiah sebagai ranting. Dari definisi tersebut kloning dimaknai sebagai kumpulan turunan suatu individu yang dihasilkan tanpa melalui perkawinan atau kumpulan perbanyakan sebagian atau seluruh makromolekul (DNA atau antibodi). Kloning dapat juga berarti kumpulan molekul atau sel yang memiliki identitas yang sama dengan molekul atau sel penurunnya. Suatu individu yang tumbuh dari sel somatik induk serta memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya.Kloning gen merupakan suatu terobosan  baru

untuk mendapatkan sebuah gen yang mungkinsangatdibutuhkanbagikehidupanmanusia. Kloning gen meliputiserangkaian proses isolasifragmen DNA spesifikdarigenomsuatuorganisme, penentuansekuen DNA, pembentukanmolekul DNA rekombinan, danekspresi gen target dalamselinang.Kloning gen padabakterimelibatkanpemisahan DNA tertentu yang diinginkandarisebagianbesarkromosommelaluimolekulpembawa DNA. Proses selanjutnyamemodifikasi DNA tersebutdarisegipeningkatanjumlahseldanpenciptaansejumlahsalinannyadalamtiap sel. Kloningidentikdenganperbanyakansalinan sel.Ketikakeseluruhan DNA darisuatuorganismediekstraksi, makaakandiperolehseluruh gen yang dimilikiolehorganismetersebut.

Kloning gen memilikidampakuntukmeniadakan DNA yang tidakdiinginkandanhanya DNA tertentu yang akandiisolasi, dimurnikan, dandiperbanyak.Penentuansekuen DNA melaluisekuensingbertujuanuntukmemastikanfragmen DNA yang kitaisolasiadalah gen target sesuaidengankehendakkita. Gen target yang kitaperolehselanjutnyakitaklondalamsebuahvektor (plasmid, phage ataucosmid) melaluiteknologi DNA rekombinan yang selanjutnyamembentukmolekul DNA rekombinan. DNA rekombinan yang dihasilkankemudianditransformasikedalamselinang (biasanyaselbakteri, misalnya strain E. coli) untukdiproduksilebihbanyak. Gen-gen target yang ada di dalamselinangjikadiekspresikanakanmengahsilkanproduk gen yang kitainginkan.

Ketikakeseluruhan DNA darisuatuorganismediekstraksi, makaakandiperolehseluruh gen yang dimilikiolehorganismetersebut. Kloninggen memilikidampakuntukmeniadakan DNA yang tidakdiinginkandanhanya DNA tertentu yang akandiisolasi, dimurnikan, dandiperbanyak.

Kloning gen bertujuanuntuk :

a. Menentukanurutanbasanukleotidapenyusun gen tersebut.

b. Menganalisisataumengidentifikasiurutanbasanukleotidapengendali gen tersebut.

c. Mempelajarifungsi RNA/protein/ enzim yang disandi gen tersebut.

d. Mengidentifikaismutasi yang terjadipadakecacacatan gen yang mengakibatkanpenyakitbawaan.

e. Merekayasaorganismeuntuktujuantertentu, misalnyamemproduksi insulin, mengajukantanaman yang tahanterhadaphama, dsb.

Kloning DNA dapatdiperolehdari DNA kromosomorganismeitusendiriatau yang dihasilkandariperbanyakandenganteknik PCR, dandapat pula menggunakan mRNA sebagaisumbercetakan yang akanmenghasilkancDNA (complementary DNA).

• SintesiscDNA  

Complementary DNA (cDNA) merupakan DNA yang disintesis dari template mRNA dalam sebuah reaksi yang dikatalis oleh enzim reverse transcriptase. cDNA biasanya digunakan untuk kloning gen eukariot dalam prokariot. Hal ini dilakukan bila ingin mengekspresikan protein tertentu dalam selyang secara normalnya tidak mengekspresikan protein tersebut (contohnya ekspresi heterolog), mereka akan mentranfer cDNA yang mengkode protein tersebut ke dalam sel donor (sel penerima). cDNA juga diproduksi oleh kelompok retrovirus (seperti HIV-1, HIV-2, Simian Immunodeficiency Virus, dan lain sebagainya) yang terintegrasi dengan inangnya untuk membuat sebuah provirus (calon virus).

Menggunakan cDNA dalam beberapa kegiatan molekular cenderung lebih aman dibandingkan RNA (mRNA) secara langsung. Hal ini dikarena kestabilan dari RNA itu sendiri yang mudah sekali terdegradasi oleh RNAse. Sehingga untuk berkerja dengan RNA secara langsung menjadi kurang efisien karena membutuhkan tingkat kehati-hatian yang cukup tinggi. Oleh karena itu, cara yang dianggap paling efektif dan efisien ketika ingin berkerja dengan RNA, yaitu dengan menggunakan sekuens komplemen dari mRNA tersebut yang selanjutnya dalam prosesnya menghasilkan cDNA. Begitupula, penyelidikan dengan DNA Microarray juga mengkonversi mRNA menjadi cDNA untuk memproduksi probesnya.

Secara deskripsi, cDNA merupakan untai ganda DNA yang dibuat dari mRNA baik berasal dari prokariot maupun eukariot. Ketika mRNA berhasil diisolasi, maka diperlukan beberapa reagent yang sangat penting dalam proses konversi tersebut yaitu dNTPs (dGTP, dCTP, dATP and dTTP), primer, dan enzim reverse transcriptase. Selanjutnya yang harus dilakukan adalah mencampurkan mRNA dengan campuran reagen tersebut untuk membuat untai komplemen dari DNA (sintesis untai pertama). Proses ini memakan waktu 10-60 menit tergantung enzim reverse transkriptase yang digunakan. Kemudian mRNA harus dihilangkan dan untai kedua DNA dapat disentesis. Secara umum proses tersebut digambarkan sebagai berikut :

1. mRNA

mRNA atau yang dikenal dengan messenger RNA merupakan untai tunggal yang membawa kode genetik yang siap untuk ditranslasikan di ribosom menjadi sebuah atau beberapa protein tertentu. Perlu diketahui bahwa tidak semua RNA bisa langsung digunakan sebagai template untuk dibuat sebagai cDNA kaitannya untuk mempelajari ekspresi suatu gen. Sebut saja RNA yang disandikan oleh kelompok eukariot dimana RNA tersebut masih mengandung sekuens asam nukleat yang tidak menyandikan protein tertentu atau yang dikenal dengan intron. Oleh sebab itu intron tersebut perlu dihilangkan sebelum digunakan sebagai templet untuk membuat cDNA. Sebaliknya sebagian besar RNA dari prokariot bisa langsung digunakan sebagai templet untuk membuat cDNA karena tidak memiliki intron.

2. dNTPs

dNTPs atau kependekan dari deoksi nucleotida triphosphate merupakan larutan yang mengandung monomer penyusun DNA (Guanin, Adenin, Sitosin dan Timin). Bahan ini sangat penting untuk kelanjutan sintesis cDNA dari mRNA. Tanpa adanya dNTPs maka proses penyusunan komplemen dari mRNA yang akan ditranskrip balik dengan bantuan enzim reverse transkriptase tidak akan berjalan karena tidak ada monomer yang bisa dipolimerisasi menjadi untai cDNA.

3. Enzim Reverse Transcriptase

Enzim reverse transkriptase merupakan enzim yang digunakan untuk mensintesis mRNA menjadi untai DNA. Di alam, banyak sekali jenis enzim ini yang secara umum dimiliki oleh virus-virus yang memiliki asam nukleat berupa RNA seperti HIV. Adapun enzim reverse transkriptase yang banyak digunakan untuk membuat cDNA di antaranya adalah M-MLV reverse transkriptase dari Moloney murine leukemia virus dan AMV reverse transkriptase dari avian myeloblastosis virus. Enzim ini akan bekerja dari ujung 3′ ke ujung 5′ dari mRNA.

4. Primer.

Terdapat tiga jenis primer yang dapat digunakan untuk mensintesis cDNA:

1) Jika mRNA memiliki poly-A pada ujung 3′, maka primer oligo-dT dapat digunakan sebagai primer untuk semua mRNA secara simultan. Umumnya primer jenis ini digunakan apabila mRNA yang digunakan berasal dari sel eukariot, sebab pada sel eukariot sel akan menambahkan poly-A (melakukan adenilasi) pada ujung 3′ setelah proses splicing untuk menghilangkan intron.

2) Jika cDNA yang akan dibuat berasal dari mRNA tertentu (mRNA target) maka penggunaan primer spesifik dapat dilakukan. Primer jenis umumnya digunakan pada mRNA dari sel prokariot karena mRNA dari sel prokariot tidak mengandung poly-A (sel tidak melakukan poly adenilasi. 

3) Jika cDNA yang akan dibuat berasal dari seluruh mRNA secara acak, maka random primer dapat digunakan. 

Namun, pemilihan primer secara umum adalah tergantung pada jenis kebutuhan dan target mRNA yang digunakan.

• Perbanyakan dengan PCR

PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) pada  daerah tertentu dari target DNA.Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Umumnya keadaan ini dilakukan antara 20 –40 siklus. Target DNA yang diinginkan (short ”target” product) akan meningkat secara eksponensial setelah siklus keempat dan DNA non-target (long product) akan meningkat secara linier.

Tahap Denaturasi Awal.

Denaturasi sempurna template DNA pada permulaan PCR merupakan salah satu hal penentu suksesnya reaksi PCR. Tidak sempurnanya denaturasi DNA menyebabkan penggunaan template yang tidak efisien pada permulaan siklus amplifikasi dan hasil PCR yang kurang baik. Denaturasi awal harus dilakukan sekitar 1-3 menit pada suhu 95°C jika kandungan GC dari DNA target adalah 50% atau kurang. Interval ini dapat ditingkatkan hingga10 menit jika kandungan GC dari DNA templet sangat tinggi.

Jika denaturasi awal kurang dari 3 menit pada suhu 95°C, Taq DNA Polymerase dapat ditambahkan pada campuran saat reaksi awal. Jika waktu denaturasi awal yang diperlukan sangat lama atau suhu yang digunakan sangat tinggi, maka Taq DNA Polymerase harus ditambahkan setelah denaturasi awal untuk menjaga stabilitas enzim yang secara drastis turun pada suhu lebih dari 95°C.

Tahap Denaturasi.

Biasanya denaturasi selama 0.5 – 2 menit pada suhu 94-95°C sudah cukup baik, ketika produk PCR yang disintesis pada siklus amplifikasi awal cukup pendek dari pada templet DNA dan telah terdenaturasi secara sempurna pada kondisi tersebut. Jika DNA yang diamplifikasi memiliki kandungan GC yang cukup tinggi, waktu denaturasi sebaiknya ditingkatkan mecapai 3-4 menit. Selain itu penambahan bahan untuk membantu proses denaturasi dapat dilakukan misalnya dengan gliserol (hingga 10-15 %), DMSO (hingga 10%) atau formamid (hingga 5%). Dengan adanya bahan tersebut, temperatur anealing harus diatur secara experimental, mengingat Tm dari primer-templat menurun secara signifikan ketika bahan-bahan tersebut digunakan. Jumlah enzim dalam reaksi harus ditingkatkan hingga 50%, mengingat DMSO dan formamid, pada konsentrasi tersebut menghambat aktivitas Taq DNA Polymerase. Selain itu, ada cara umum yang dapat dilakukan untuk mengurangi Tm dari produk PCR yaitu dengan mengganti dGTP dengan 7-deaza-dGTP dalam campuran reaksi.

Tahap Annealing Primer.

Biasanya suhu optimal anealing adalah 5°C lebih rendah dari temperatur melting (Tm) primer-template DNA duplex. Inkubasi selama 0.5-2 menit biasanya sudah cukup. Namun, jika diperoleh produk PCR yang tidak spesifik, maka suhu anealing dapat ditingkatkan pada tahap tersebut 1-2°C.

Tahap Extending.

Biasanya tahap pemanjangan (extending) ini dilakukan pada suhu 70-75°C. Kecepatan sintesis DNA oleh Taq DNA Polymerase pada suhu tersebut sangat tinggi. Periode dari tahap ini yang direkomendasikan adalah 1 menit untuk mensintesis fragmen PCR hingga 2 kb. Apabila fragmen DNA yang lebih besar yang akan diamplifikasi, maka waktu extensinya di tingkatkan menjadi 1 menit tiap 1 kb.

Jumlah Siklus.

Jumlah siklus PCR tergantung dari jumlah template DNA dalam campuran reaksi dan jumlah produk PCR yang diinginkan. Untuk kurang dari 10 salinan dari templet DNA, dapat dilakukan sebanyak 40 siklus. Jika jumlah awal templet DNA cukup tinggi, maka 25-35 siklus sudah cukup.

Tahap Extending Akhir.

Setelah akhir siklus, sampel biasanya di inkubasikan pada suhu 72°C selama 5-15 menit yang bertujuan untuk menyelesaikan penggandaan yang belum selesai dari produk PCR baru. Juga, pada tahapan ini, aktifitas akhir transferasi dari Taq DNA Polymerase akan menambahkan nukleotida A pada ujung 3′ produk PCR. Selanjutnya, jika fragmen PCR ini akan digunakan untuk diklon pada vektor, biasanya diperlukan waktu sekitar 30 menit.

Kloning DNA memerlukanbeberapasaranauntuktercapainyaperbanyakan gen yang dibutuhkan; enzim endonuclease restriksiuntukmemotong DNA, enzim ligase untukmenyambungkan DNA, vector yang berfungsisebagaiwahanauntukmemasukkan DNA kedalamsel agar DNA dapatdisimpandandiperbanyakdalamseltersebut, danselinang (host biasanyadigunakanbakteri Escherichia coli).

Enzim endonuclease restriksi yang digunakanuntukmemotong DNA menghasilkanduahasilpotonganpada pita DNA; dikenaldenganujunglengketdantumpul (blunt and sticky ends).

Pita DNA yang telahdipotongpadatempat yang ditentukantersebutdapatdisambungkankembalidenganmenggunakanenzim ligase.Enzim ligase membentukikatanfosfodiesteruntukmerekatkanbenang-benang DNA.

Vektorberupa Plasmid.

Wahana yang digunakanuntukmenyisipkan DNA kedalamselinang (vector) digunakan Plasmid.Plasmid dapatdimodifikasiuntukmembawa potongan DNA lain kedalamselkarenamemilikireplikator (penandaawalmulaterjadinyareplikasi –origin of replication), penanda (marker), sehinggadapatdiseleksi ( mis. gen ketahananterhadapantibiotik), memilikibanyaksitusuntukmengklon ( - multiple cloning sites -  potongan DNA yang memilikiurutanbasanukleotida yang menjadisasaranenzimrestriksitetapitidakterletakpadadaerahreplikatoratausituspenanda), sertamudahdiisolasidariselinang. Plasmid bakteri tak hanya sendiri menjadi wahana penyisipan DNA ke dalam sel inang. Vektor lain yang dapat digunakan berupa bakteriofaga, cosmid, BACs ( bacterial artificial choromosme), dan YAC (Yeast artificial chromosome).  

Vektor berupa Bakteriofaga

Pengaruh interaksi bakteriofaga terhadap bakteri inangnya dapat digunakan untuk keperluan molekuler atau pengendalian hayati. Penggunaan bakteriofaga umumnya digunakan dibidang pertanian dan telah banyak ditemui bakteri-bakteri penting dan umum seperti pada Agrobakterium, Pseudomonads, Bacillus, Xylella dan lainnya. Beberapa diantaranya dapat meningkatkan kemampuan bakteri sebagai penyebab penyakit pada tumbuhan, kemampuan bakteri untuk resisten terhadap antibiotik dan bahan kimia tertentu bahkan mungkin di antaranya ada yang menghasilkan toksin yang dapat mempercepat kematian tumbuhan inang seperti halnya pada bakteri hewan dan manusia. Vektor berupa bakteriofaga bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran besar mulai dari 10-23 kbp dan dapat dilaksanakan seleksi berdasarkan ukuran. Hanya saja menggunakan bakteriofaga sebagai vektor lebih sulit pengerjaaannya dari vektor plasmid. Disamping itu beberapa bakteri tidak memiliki plasmid yang kompetible dengan  bakteriofaga tersebut (biasanya high copy, ukurannya tidak terlalu besar dan dapat bereplikasi secara mandiri pada sel bakteri inang). 

Dengan sedikit modifikasi asam nukleat pada phage-based vector/plasmid, misalnya dengan menambahkan/menyisipkan gen tertentu yang mempermudah pendeteksian maka hal ini akan sangat berguna sekali. Sebagai contoh dengan menyipkan gen ketahanan terhadap antibiotik atau penghasil warna tertentu (GFP). Beberapa laporan menunjukkan bahwa penggunaan GFP (Green Fluoroscens Protein) sangat efektif untuk melakukan pendeteksian terutama monitoring keberadaan bakteri yang sebelumnya telah ditranformasikan phage-based plasmid yang membawa GFP. Contoh nyata adalah pemanfaatan phage-based plasmid/vector untuk keperluan monitoring pergerakan bakteri penyebab layu pada tanaman yang disebabkan oleh Ralstonia solanacearum. 

DNA bakteriofaga yang diisolasi dari partikel faga mempunyai konformasi linier untai ganda dengan panjang 48,5 kb. Namun, masing-masing ujung fosfatnya berupa untai tunggal sepanjang 12 bp yang komplementer satu sama lain sehingga memungkinkan DNA bakteriofaga untuk berubah konformasinya menjadi sirkuler. Dalam bentuk sirkuler, tempatbergabungnya kedua untai tunggal sepanjang 12 pb tersebut dinamakan kos. Secara alami terdapat lebih dari satu tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi yang biasa digunakan. Olehkarena itu, DNA bakteriofaga tipe alami tidak cocok untuk digunakan sebagai vektor kloning. Akantetapi, saat ini telah banyak dikonstruksi derivat-derivat DNA bakteriofaga yang memenuhi syarat sebagai vektor kloning. Ada dua macam vektor kloning yang berasal dari DNA bakteriofaga :

(1) vektor insersional, yang dengan mudah dapat disisipi oleh fragmen DNA asing,

(2) vektor substitusi, yang untuk membawa fragmen DNA asing harus membuangsebagian atau seluruh urutan basanya yang terdapat di daerah nonesensial danmenggantinya dengan urutan basa fragmen DNA asing tersebut.

Di antara kedua macam vektor tersebut, vektor substitusi lebih banyak digunakan karena kemampuannya untuk membawa fragmen DNA asing hingga 23 kb.Cara substitusi fragmen DNA asing pada daerah nonesensial membutuhkan dua tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi. Jika suatu enzim restrisksi memotong daerah nonesensial di dua tempat berbeda, maka segmen DNA bakteriofaga di antara kedua tempat tersebut akan dibuang untuk selanjutnya digantikan oleh fragmen DNAasing. Jika pembuangan segmen DNA bakteriofaga tidak diikuti oleh substitusi fragmen DNAasing, maka akan terjadi religasi vektor DNA bakteriofaga yang kehilangan sebagian segmen padadaerah nonesensial. Vektor religasi semacam ini tidak akan mampu bertahan di dalam sel inang. Dengan demikian, ada suatu mekanisme seleksi automatis yang dapat membedakan antara sel inang dengan vektor rekombinan dan sel inang dengan vektor religasi. 

Bakteriofaga mempunyai dua fase daur hidup, yaitu fase litik dan fase lisogenik. Pada fase litik, transfeksi sel inang (istilah transformasi untuk DNA fag) dimulai denganmasuknya DNA yang berubah konformasinya menjadi sirkuler dan mengalamireplikasi secara independen atau tidak bergantung kepada kromosom sel inang. Setelah replikasi menghasilkan sejumlah salinan DNA bakteriofaga sirkuler, masing-masing DNA ini akan melakukan transkripsi dan translasi membentuk protein kapsid (kepala). Selanjutnya, tiap DNA akan dikemas (packaged) dalam kapsid sehingga dihasilkan partikel bakteriofaga baru yangakan keluar dari sel inang untuk menginfeksi sel inang lainnya. Sementara itu, pada faselisogenik DNA bakteriofaga akan terintegrasi ke dalam kromosom sel inang sehingga replikasinya bergantung kepada kromosom sel inang. Fase lisogenik tidak menimbulkan lisis pada sel inang. Di dalam medium kultur, sel inang yang mengalami lisis akan membentuk plak (plaque) berupa daerah bening di antara koloni-koloni sel inang yang tumbuh. Oleh karena itu, seleksi vektor rekombinan dapat dilakukan dengan melihat terbentuknya plak tersebut.

Vektor berupa Kosmid

Kosmid merupakan vektor yang dikonstruksi dengan menggabungkan kos dari DNA bakteriofaga dengan plasmid. Kemampuannya untuk membawa fragmen DNA sepanjang 32 hingga 47 kb menjadikan kosmid lebih menguntungkan daripada bakteriofaga dan plasmid.

Setelah pemotongan plasmid dengan menggunakan enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan. Potongan-potongan DNA asing tersebut akan tersambung dengan enzim ligase dan akan dihasilkan plasmid rekombinan. Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel inang yang sesuai. Keunggulan menggunakan plasmid sebagai vektor diantaranya mudah pengerjaannya disebabkan strategi untuk seleksi mudah dan dapat mengklon potongan DNA berukuran < 10 kbp.

Proses selanjutnya setelah penyisipan potongan DNA pada plasmid yang digunakan sebagai vektor kloning adalah transformasi sel inang, penapisan sel pengklon( screening), dan identifikasi sel pengklon yang membawa gen yang dikehendaki.roses Transformasi sel inang dimulai dari tahap Pra-Inkubasi, Inkubasi, Kejutan Panas, hingga Penyembuhan (Recovery) Pada tahap Pra-Inkubasi sel E.coli calon penerima plasmid vektor dipaparkan kepada ion positif kalsium klorida (CaCl2). Perlakuan ini memberikan cekaman kepada bakteri yang mengakibatkan membran sel dan dinding sel bakteri tersebut menjadi permabel terhadap plasmid donor. Proses ini mengakibatkan E.coli menjadi kompeten untuk menerima plasmid.Tahapan selanjutnya disebut Inkubasi dimana plasmid vektor ditambahkan ke dalam suspensi sel E.coli yang sebagian lainnya tidak ditambahkan plasmid dan digunakan sebagi kontrol. Tahap berikut diberikan Kejutan Panas (Heat Shock) pada bakteri E.coli baik yang berisi plasmid vektor maupun yang tidak ditambahkan plasmid dipaparkan selama 90 detik pada suhu 42o C. Proses ini memaksimumkan masuknya plasmid menembus membran dan dinding sel bakteri. Tahapan Penyembuhan yang dilaksanakan setelah proses kejutan panas diatas dengan menumbuhkan semua sel E.coli dalam medium kaya nutrisi untuk memberi kesempatan penyembuhan pada sel E.coli setelah proses cekaman dan kejutan panas. Biasa berlangsung selama satuu generasi waktu (pada E.coli berkisar antara 30 - 45 menit).

Tahapan Penapisan (Screening) dilakukan dengan menumbuhkan bakteri pada media selektif yang mengandung antibiotik dan mengandung senyawa tertentu X-gal. Bakteri yang membawa plasmid rekombinan akan resisten terhadap antibiotik dan tidak mampu mengubah memecah X-gal (koloni berwarna putih). 

Tahapanberikutnyadilakukandenganmenganilisiskeberadaan DNA dalam plasmid rekombinan yang terdapatpadaselinangsetelah proses transformasi. TeknikAnalisis DNA inidapatadilakukandenganbeberapacara :

a. AnalisisRestriksiDNA.Teknikinimerupakanteknik yang paling sederhana; dilakukandenganmengisolasi DNA darihasil-hasiltransformasi yang telahditumbuhkandalam media selektif. Selanjutnya DNA dipotongdenganenzimrestriksispesifik, kemudiandianalisisukuran pita DNA hasilpotonganenzimrestriksitersebut.

b. Hibridisasidengan DNA pelacak.Teknikinimenggunakanpelacak DNA yang dilabelidenganunsurradioaktif yang mempunyaikemiripandengan DNA rekombinan yang dilacak. Seldilisiskanterlebihdahulukemudiandberi DNA pelacaksehinggaterjadihibridisasiantara DNA rekombinandengan DNA pelacak. DNA hibridakanterdeteksipada film berupanoktahhitam.

c. Amplifikasi DNA denganteknik PCR. Teknikmenggunakan primer DNA berupaoligonukleotida yang komplementerdenganfragmen DNA asingataudenganbagianekorataukepalatempatpenyisipanfragmen DNA asingtersebut.

d. TeknikPenentuanurutannukleotida DNA (DNA sequencing). Teknikinibiasanyadigunakansetelah DNA asingdipastikanterlebihdahulukeberadaannyadenganteknikanalisisrestriksi DNA. Teknikinidigunakanuntukmengetahuisecararinciurtannukeotidafragmen DNA asing

 

Referensi

Anonim.Vektor Kloning. [dalam jaringan] disadur dari https://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/vektor-kloning/diakses pada 

Anonim.[dalam jaringan] disadur dari http://www.microbiologybytes.com/virology/Phages.html diakses pada 

Anonim. [dalam jaringan] disadur dari http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1389172308700021 diakses pada 

Anonim.[dalam jaringan] disadur dari http://bio1510.biology.gatech.edu/module-5-integrative-health/01-recombinant-dna/diakses pada.

Anonim.[dalam jaringan] disadur dari http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/Lab8-Biol210.htm diakses pada 

Anonim.Molecular Cloning, Technical Guide. New England, BioLabs.Inc.

Gaffar,Shabarni. 2007. Bioteknologi Molekuler.FMIPA-UNPAD.Bandung.

Smith, C., Marks, A.D., and Lieberman, M. 2005. Basic Medical Biochemistry,2nd ed, Lippincott William & Wilkins,Philadelphia.