3:24 AM Makalah Elektroforesis Gel Agarosa

Elektroforesis Gel Agarosa

Pendahuluan.

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Pada tahun 1960, para ilmuwan menemukan bahwa bakteri memiliki enzim yang memotong, atau "mencerna," DNA organisme asing dan dengan demikian melindungi sel-sel dari penjajah seperti virus.Para ilmuwan sekarang telah mengisolasi beberapa ratus enzim ini, yang dikenal sebagai enzim restriksi, atau endonuklease restriksi.Masing-masing mampu mengenali dan memotong di urutan DNA spesifik, yang dikenal sebagai urutan pengenalan (recognition sequence).Penemuan enzim restriksi membuat rekayasa genetika menjadi dapat dilakukan karena peneliti bisa menggunakannya untuk memotong DNA menjadi fragmen yang dapat dianalisis dan digunakan dalam berbagai prosedur. Pada penelitian di laboratorium digunakan elektroforesis gel untuk memisahkan sampel DNA yang telah dipotong oleh enzim restriksi. Fragmen DNA sampel ini kemudian dibandingkan ukurannya dengan fragmen DNA yang telah diketahui / dikenal untuk menganalisis DNA fragmen sampel.

Enzim restriksi yang sangat spesifik.Mereka memotong DNA hanya dalam urutan pengakuan yang sangat tepat.Semua situs pengenalan dalam DNA simetris, atau palindromic.Ini berarti bahwa urutan situs pengenalan pada satu untai DNA membaca dalam arah yang berlawanan mengikuti untai komplementernya pula.

Enzim restriksi EcoRI hanya mengenali sequen 5′-G’AATCC-3 pada pita DNA; enzim EcoRV pada situs 5′-GAT’ATC-3′ , dan SacI (5′-GAGCT’C-3′).

Memotong DNA dengan enzim restriksi dimulai dengan mencampur DNA dengan satu atau lebih enzim restriksi dalam tabung microcentrifuge plastik kecil. Total volume campuran adalah sekitar 20 ml.

Kebanyakan reaksi enzim restriksi yang diinkubasi pada suhu 37 ° C selama satu jam. Setelah inkubasi, dapat dilakukan analisis DNA dengan menggunakan teknik elektroforesis gel atau digunakanuntuk transformasi bakteri pada plasmid rekombinan lanjutan

Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran.  Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler . Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein

Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat.Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu.

Prinsip elektroforesis mengikuti gaya Lorentz yang dijabarkan sebagai berikut :

Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya.

Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik.  Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya.  Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda). Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik.  Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama.

Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari :

·         Comb; digunakan untuk membentuk ‘sumur’ pada gel agarose.

·         Tray; digunakan untuk sebagai cetakan gel agarose.

·         Chamber; digunakan sebagai wadah gel agarose.

·         Sumber listrik; digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis.

Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida  yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel .

Elektroforesis gel menggunakan gel Agarose yang berfungsi sebagai matriks penyaring molekul. Pemilihan gel bergantung pada ukuran molekul yang akan dielektroforesis. Gel Agarose ditujukan untuk memisahkan molekul lebih dari 100 bp dan gel Poliakrilamida untuk molekul-molekul 1-300 bp, bahkan mampu untuk membedakan molekul-molekul dengan selisih panjang 1 nukeotida. Gel Agarose berasal dari polisakarida alga jenis Rhodophyla yang dimurnikan. Alga merah memiliki komponen Gelidian dan Glaucaria yang dimodifikasi residu galaktosanya didalam hubungan dengan polisakarida agropefin dibentuk agar.Agarose larut pada buffer (TAE; tris-acetate-EDTA) yang mendidih kemudian didinginkan.Hasil dicetak pada cetakan gel yang ditempatkan pada suhu kamar.

Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:

1.       Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.

2.       Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.

3.       Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar.

Elektroforesis gel juga menggunakan gel poliakrilamida yang dibentuk dari akrilamida dan N,N'-methyle-bis-akrilamida yangg dihubungkan dengan reaksi polimerisasi dengan penambahan ammonium perishulphate dan N,N,N,N'-tetramethylethylenediamin (TEMED). TEMED merupakan katalis yang dibentuk dari radikal bebas ion perisulfate dan diinisiasi polymerization dari acrilamida.Poliakrilamida dapat dikondisikan sebagai polimer yang netral, kationik, anionik, atau atmosfer dengan sifat fisika dan kimia, atau dengan panjang dan berat molekul yang bervariasi.Larutan penyangga / buffer ditambahkan untuk menjaga kesetimbangan pH dan memberikan fungsi konduktivitas untuk ion. Selain larutan buffer TAE, elektroforesisi DNA juga digunakan larutan TBE ( -tris-borate-EDTA) dan loading buffer.

Menyiapkan dan Menjalankan Elektroforesis Gel DNA

Peralatan dan perlengkapan yang diperlukan untuk melakukan elektroforesis gel agarosa meliputi:

·         Alat Elektroforesis (cetakan gel dan tangki larutan penyangga elektroda)dan  power supply.

·         Baki penuangan, yang tersedia dalam berbagai ukuran dan terdiri dari plastik transparan-UV. Ujung terbuka dari baki ditutup dengan pita sementara gel sedang cor, kemudian dihapus sebelum elektroforesis.

·         Sisir sampel, sekitar yang agarosa cair dituangkan untuk membentuk sumur sampel pada gel.

·         Elektroforesis penyangga, biasanya Tris-asetat-EDTA (TAE) atau Tris-borat-EDTA (TBE).

·         Loading buffer;  berisi sesuatu yang padat (misalnya gliserol) untuk memungkinkan sampel untuk "jatuh" ke dalam sumur sampel, dan satu atau dua pewarna pelacakan, yang bermigrasi dalam gel dan memungkinkan pemantauan visual atau seberapa jauh elektroforesis telah berlangsung.

·         Ethidium bromide, pewarna fluorescent yang digunakan untuk pewarnaan asam nukleat CATATAN:. Bromide Ethidium diketahui sebagai mutagen dan dianggapsebagai bahan kimia berbahaya –harus memakai sarung tangan saat menggunakannya.

·         Transilluminator (sebuah lightbox ultraviolet), yang digunakan untuk memvisualisasikan ethidium bromide-bernoda DNA dalam gel.

CATATAN:.Selalu memakai kacamata pelindung saat mengamati DNA pada transilluminator untuk mencegah kerusakan mata dari sinar UV.

Penuangan gel.

Bubuk agarosa dicampur dengan elektroforesis penyangga dengan konsentrasi yang diinginkan, kemudian dipanaskan dalam oven microwave sampai benar-benar mencair.Etidium bromida ditambahkan ke gel (umumnya konsentrasi akhir 0,5 ug / ml) untuk memfasilitasi visualisasi DNA setelah elektroforesis.Setelah larutan dingin kurang lebih pada suhu sekitar 60^o C, kemudian dituangkan ke dalam baki penuangan berisi comb sample dan dipadatkan pada suhu kamar.

Setelah gel memadat, comb sample kemudian diangkat dengan hati-hati supaya tidak mengoyak bagian bawah 'sumur'. Gel yang berada dalam baki penuangan, dimasukkan secara horizontal ke ruang elektroforesis dan dilapisi dengan buffer. Sampel yang mengandung DNA dicampur dengan loading buffer kemudian dipipet ke 'sumur' sampel,kemudian ditutup dan disambungkan dengan peralatan dan arus listrik dijalankan.Arus yang mengalir dapat dikonfirmasi dengan mengamati gelembung yang timbul  elektroda. DNA akan bermigrasi ke arah elektroda positif, yang biasanya berwarna merah.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik mulai dialirkan menuju alat tersebut. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya.Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus.Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.

Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel.Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya.Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.

Jarak DNA yang bergerak di dalam gel dapat divisualisasi dengan memantau pergerakan warna pelacakan.Pewarna Bromophenol cyanol biru dan Xilena  bergerak melalui gel agarosa di sekitar tingkat yang sama seperti pada fragmen DNA untai ganda yaitu masing-masing menanda 300 dan 4000 bp.Fragmen DNA kemudian dapat divisualisasikan dengan pewarnaan etidium bromida. Pewarna yang dijadikan dasar pembeda anatara DNA dan RNA ini dapat ditambahkan ke dalam gel selama elektroforesis atau gel dapat diwarnai setelah elektroforesis dengan merendam gel ke dalam larutan encer etidium bromida.Untuk memvisualisasikan DNA atau RNA, gel ditempatkan pada transilluminator ultraviolet. Sebaiknya pemeriksaan fotografi dilakukan tidak lama setelah proses elektroforesisselesai karena DNA akan menyebar dalam gel dari waktu ke waktu.

Beberapa faktor tambahan memiliki efek penting pada pergerakan fragmen DNA dalam gel agarosa. Faktor-faktor utama adalah:

1.    Konsentrasi agarosa.

Perbedaan ukuran fragmen DNA dapat diatasi dengan menggunakan gel agarosa yang memiliki konsentrasi berbeda.Konsentrasi gel agarosa yang lebih besar memfasilitasi pemisahan fragmen DNA yang lebih kecil, sementara konsentrasi agarosa rendah memungkinkan pemisahan bagi fragmen DNA yang lebih besar.Pada gambar ditunjukkan pergerakan dari serangkaian fragmen DNA dalam tiga konsentrasi agarosa, yang semuanya dalam baki gel yang sama dan dielektroforesis pada tegangan yang sama.  fragmen yang lebih besar jauh lebih baik dipaparkan  dalam konsentrasi gel agarosa 0,7% , sedangkan fragmen kecil yang dipisahkan pada konsentrasi 1,5% agarose. 1000 bp fragmen ditunjukkan di setiap jalur.

2.    Tegangan.

Tegangan listrik diberikan untuk meningkatkan kemampuan gel dalam memisahkan fragmen DNA. Resolusi terbaik fragmen yang lebih besar dari sekitar 2 kb dicapai dengan memberikan tegangan listrik pada gel agarosa tidak lebih dari 5 volt per cm  (nilai cm adalah jarak antara dua elektroda, bukan panjang gel).

3.    Larutan penyangga (Buffer) Elektroforesis.

Beberapa buffer yang berbeda telah direkomendasikan untuk elektroforesis DNA.Yang paling sering digunakan untuk perakitan DNA adalah TAE (Tris-asetat-EDTA) dan TBE (Tris-borat-EDTA). Fragmen DNA akan bergerak pada tingkat yang agak berbeda dalam dua buffer ini karena perbedaan kekuatan ion. Larutan penyangga tidak hanya membangun pH, tetapi memberikan ion untuk mendukung konduktivitas.Kekeliruan dalam menggunakan larutan penyangga dapat menyebabkan tidak adanya pergerakan fragmen DNA pada gel agarosa.Penggunaan larutan penyangga yang berlebihan dapat pula menghasilkan panas yang tidak sesuai hingga mencairkan kembali gel agarosa.

4.    Pengaruh Ethidium Bromide.

Ethidium bromide adalah pewarna berpendar yang ditambhakan antara dasar asam nukleat dan memungkinkan deteksi visual fragmen DNA dalam gel.Ethidium bromide dapat dimasukkan ke dalam gel agarosa, atau ditambahkan ke sampel DNA sebelum dimasukkan ke dalam 'sumur' pada gel agarosa untuk memungkinkan visualisasi fragmen dalam gel. Pengikatan etidium bromida dengan DNA dapat mengubah massa dan kekakuan DNA karena mobilitasnya.

Referensi

Anonim.[dalam jaringan] disadur dari http://www.phschool.com/science/biology_place/labbench/lab6/design2.htmldiakses pada..

Anonim.[dalam jaringan] disadur dari http://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekular/ diakses pada..

Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide. Academic Press, Inc., San Diego.

Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5.Erlangga : Jakarta.

Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology 2nd ed. Appleton & Lange, Norwola.

Fairbanks, D.J., W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life. Brooks/Cole Publishing Company, New York.

Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical Chemistry.Journal of Medical Biochemistry 2010.

Klug, W.S., M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics 4th ed. Merrill Publishing Co. : Columbus, Ohio.

Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech Publisher : Rijeka, Croatia.